动物繁殖学实验实习指导

 

（试行本）

 

编者：潘庆杰、田文儒、宋学雄、吕永燕

 

 

 

 

 

 

 

 

莱阳农学院动物科技学院

 

2004年1月

 

 

 

动物繁殖学实验实习指导

 

实验一    动物生殖器官的观察

实验二    动物睾丸、卵巢及附性器官的组织学观察

实验三    PMSG或FSH的生物测定法

实验四    精液品质常规检查及理化因素的影响

实验五    精子数量计算和畸形率的测定

实验六    精子顶体完整率的测定

实验七    人工授精器械的认识及假阴道的准备

实验八    动物精液的冷冻操作

实验九    动物的发情鉴定

实验十    母牛的直肠检查

实验十一  动物的采精与输精

实验十二  动物的胚胎观察与鉴定

实验十三  牛、羊的胚胎移植

实验十四  卵母细胞体外培养与体外受精

 

 

 

 

实验一  动物生殖器官的观察

 

一、实验目的

认识各种动物生殖器官的形态、大小，及其特点，为生殖器官的直肠检查、阴道检查、妊娠诊断及人工授精等操作奠定基础。

二、实验材料

1、各种雄性动物生殖器官标本、模型及挂图

2、各种雌性动物活体及生殖器官标本、模型及挂图。

3、解剖刀、剪刀、镊子、卷尺、搪瓷盘。

4、腹腔镜：主件（观察镜、变压器、光源、光缆），附件（套管针、探针、照相设备、监视系统、手术器械、送气设备、抽吸装置）。

三、实验内容

（一）雄性动物生殖器官

1、观察各种动物睾丸和附睾的形状、相对位置和大体构造。

睾丸均为长卵圆形，牛、羊、猪的睾丸相对较大，尤其是羊的最大。马睾丸的纵轴方向与地面平行；附睾位于睾丸的背外缘，头端在前、尾端在后。牛、羊睾丸的方向与地面垂直；其附睾位于后缘，头端在上，尾端在下。猪睾丸的方向呈前低后高倾斜，位于股部之后；附睾位于睾丸的前上缘，头端在下，尾端在上。

2、副性腺：比较各种动物副性腺的大小、形状、位置及内部构造。

①精囊腺：成对位于膀胱颈背面的两旁，输卵管的末端两侧。

马的精囊腺为长圆形囊状，牛、羊和猪的精囊腺都是由紧密的腺体组织所构成，猪的特别发达。

②前列腺：位于膀胱颈尿道开始处精囊腺之后。

马的前列腺，由两个侧叶和一个峡所构成，形似蝴蝶。牛和猪的前列腺分为体部和弥散部两部分，羊的前列腺最不发达，只有弥散部。

③尿道球腺：位于骨盆出口附近的尿道两旁，各有一个排出管开口于尿道内。

猪的尿道球腺最为发达，呈圆柱状，上面覆盖的尿道肌很薄。其它家畜的呈球状，上面覆盖的尿道肌较厚。在尿生殖道骨盆部的腹面中线上作纵切口，观察尿道上壁的精阜，上有射精孔。前列腺的开口在两侧，尿道球腺的开口在其后方。

3、阴茎和龟头：阴茎由白膜内的两个阴茎海绵体和其腹面的尿道海绵体组成，为阴茎的勃起组织。马的阴茎长而粗大，龟头窝内有尿道突，牛的阴茎在阴囊之后形成一“S”状弯曲。羊的阴茎比牛的细小，尿道突细而长，绵羊的较长，山羊的较短。猪的阴茎“S”状弯曲在阴囊之前，龟头呈螺旋状。

（二）雌性动物生殖器官

雌性动物可以观察生殖器官的标本、模型及挂图，也可以采用腹腔镜法进行活体观察。

1、生殖器官的组成及位置

雌性动物的生物器官包括：卵巢、输卵管、子宫、阴道、尿生殖前庭、阴唇和阴蒂。前四部分称为内生殖器官，后三部分称为外生殖器官，也称外阴部。

雌性动物的整个生殖器官都位于骨盆腔和骨盆腔前方的腹腔内，上面为直肠和小结肠，下面是膀胱。

2、卵巢

①观察未孕动物性周期各时期卵巢的外形并测量其体积。

②作卵巢的水平切面，观察其内部构造。

马的卵巢：为豆形，体积如鸽蛋大，成熟后卵巢的一边（自由边）内陷形成排卵窝，朝向内侧的输卵管伞。发情周期的不同时期马卵巢的直径大小不等。

牛的卵巢：为椭圆形，没有排卵窝，如青枣大，排卵以后多不形成红体，黄体往往凸出于卵巢表面。其位置在两侧子宫角尖端的外侧下方。

羊的卵巢：比牛的圆，体积也小，其他特点同牛。

猪的卵巢：有很发达的卵巢囊，卵巢和输卵管伞有时被包在卵巢囊内，其形状随机体成熟的程度而有不同。幼小母猪卵巢的形状极似肾脏，接近性成熟时为桑椹形，达到性成熟时似串状葡萄。

3、输卵管

观察输卵管的形状及其与卵巢、子宫角的关系。

马的输卵管有很多弯曲，伞较发达。

牛、羊的输卵管弯曲较少，伞不发达。

猪的输卵管有许多小弯曲，输卵管伞最发达。其伞的开口接近卵巢囊的底部。

各种动物输卵管的子宫端均与子宫角尖端相连，马及猪的输卵管与子宫角之间具有明显界限，牛、羊的则不明显。

4、子宫

①观察子宫角和子宫体的形状、粗细、长度及粘膜上的特点（沿子宫大弯切开）；

②观察子宫颈的粗细、长度及其构造特点；

③沿阴道上面纵切，观察阴道和子宫颈及前庭的关系。

马：其整个子宫呈“丫”形，子宫角为扁带状。小弯在上，大弯在下，子宫颈外口突入阴道，子宫颈的肌肉层比较薄，管道比较粗。

牛、羊：其子宫角的形状如同弯曲的绵羊角，大弯向上，小弯向下，子宫粘膜上有子宫阜，且羊子宫阜的中央有一个小的凹陷。牛、羊子宫颈的肌肉层发达，坚硬，管道细且有大而厚的皱襞，子宫颈外口突出于阴道，但较马的短，似菜花样。

猪：其子宫角长而有许多弯曲，子宫颈与子宫体、阴道都没有明显的界限，子宫颈管的粘膜上有两排交错的突起。

5、阴道是由阴道穹窿至处女膜（阴道外口）的管道部分。

6、外生殖器官：包括尿生殖前庭、阴唇及阴蒂。

①尿生殖前庭：由处女膜至阴门的部分。

②阴唇及阴蒂是雌性动物生殖道的最后一部分。

实验二  动物睾丸、卵巢及其他性器官的组织学观察

 

一、目的要求：

通过对雄性动物睾丸和雌性动物卵巢、子宫、输卵管组织切片的观察，了解睾丸、卵巢、子宫、输卵管的组织结构及其形态。了解精子的发生过程，卵子的发生、卵泡的发育过程及其形态。

二、实验材料：

1、显微镜。

2、动物睾丸、卵巢、子宫、输卵管的标本及组织切片。

3、动物睾丸、卵巢、子宫、输卵管的组织图片（幻灯片）。

三、实验内容：

（一）雄性动物睾丸的组织学观察：

1、低倍镜观察：

（1）被膜：由浆膜和白膜构成。外层膜为一层较薄的固有鞘膜，内层白膜为较厚的致密结缔组织构成。

（2）纵隔和中隔：纵隔为由睾丸的一端伸向睾丸实质的结缔组织索，并向四周发出许多放射状的结缔组织小梁直达白膜，形成中隔。

（3）小叶：由中隔将睾丸实质分成许多基部向外，顶端向内的锥形小叶，每个小叶由2-3条盘曲的精细管组成。精细管之间有疏松的结缔组织，内含有血管和间质细胞。

（4）附睾：由精细管汇合成的直精细管，穿入睾丸纵隔的结缔组织，形成弯曲的睾丸网，睾丸网又分出10-20条睾丸输出管形成附睾，附睾头也由结缔组织分成若干附睾小叶，各附睾小叶的管子汇成附睾管，经附睾体，附睾尾最后过渡为输精管。

2、高倍镜观察：从睾丸小叶中仔细观察精细管及间质细胞的结构和形态。精细管的管壁的外向由结缔组织、基膜和复层的生殖上皮构成。生殖上皮又由生精细胞和支持细胞组成。仔细观察精子发生周期中主要阶段和支持细胞形态：

（1）支持细胞：又称足细胞和塞托利氏细胞。为高柱状或锥状细胞。从基膜一直伸达精细管的管腔，该细胞高低不等，界限不清，细胞核较大位于细胞基部，着色浅，核仁明显。支持细胞的游离端常嵌含有许多精子，其侧面嵌含各个发育阶段的生精细胞，并对生精细胞起支持、营养、保护、促使其发育的作用。

（2）精原细胞：是精子形成过程的干细胞，位于基膜，细胞为多边形或圆形，核大而圆，染色较深。仔细观察A、B、中间型三类。

（3）初级精母细胞：由精原细胞分裂而成，位于精原细胞内侧，排列成几层，细胞呈圆形，体积较大，着色深，经第一次成熟分裂形成二个次级精母细胞。

（4）次级精母细胞：由初级精母细胞分裂而成，位于初级精母细胞内侧，细胞体积较小，呈圆形，细胞核为球形，染色质呈细粒状，不见核仁，由于其存在时间很短，很快经过第二次成熟分裂成为二个精子细胞，因而在切片上很难找到。

（5）精子细胞：由次级精母细胞分裂而成，位于精母细胞内侧，靠近细管的管腔，排成数层，细胞呈圆形，体积更小，核小呈球状，染色深，核仁清晰。精子细胞不再分裂，在支持细胞顶部经过变态过程成为精子。

（6）精子：由精子细胞变态形成，位于精细管的管腔内，刚形成的精子头部常深入支持细胞游离端，尾部朝管腔，随着精子发育成熟，便脱离支持细胞，游离在管腔内，精子分头、颈、尾三部分，形似蝌蚪，头部多呈扁卵圆形，染色深。

（7）附睾管：管壁由环形平滑肌纤维和假复层柱状纤毛细胞和基底细胞组成，柱状细胞有分泌作用，基底细胞紧贴基膜，外形为圆形或卵圆形，染色较浅，核呈球形，精子在附睾管内借助分泌液，纤毛运动和管壁蠕动来运行。

（二）雌性动物卵巢的组织学观察：

卵巢的组织由被膜、皮质和髓质组成。

1、低倍镜观察：

（1）被膜：卵巢表面由特殊的生殖上皮被覆，生殖上皮多为单层立方形细胞组成。生殖上皮下面有一层致密结缔组织形成的白膜。

（2）皮质：位于卵巢的外周，占大部分，与髓质无明显界限，由许多不同发育期的卵泡和少量黄体等组成。

（3）髓质：位于卵巢的中央（马属动物例外），由富有弹性纤维的疏松结缔组织构成。内有大量的血管、淋巴管和少量平滑肌纤维。

2、高倍镜观察：主要观察卵巢皮质部不同发育阶段的卵泡，每个卵泡都由位于中央的卵母细胞和围绕在卵母细胞周围的卵泡细胞组成。

（1）原始卵泡：位于生殖上皮层内，中间为一卵原细胞，周围由一层扁平卵泡细胞所围绕。

（2）初级卵泡：卵泡呈球形，卵原细胞位于卵泡中央，周围包有一层立方或柱状的卵泡细胞。卵原细胞的体积较大，中央有个圆形的泡状核，核内染色质较少，着色较浅，核仁明显。

（3）次级卵泡：其主要变化是卵原细胞体积增大，卵母细胞和颗粒细胞共同分泌出粘多糖，聚集在颗粒细胞与卵黄膜之间形成透明带。

（4）三级卵泡：出现小的卵泡腔，随着卵泡的生长，许多小腔合并为一个大的卵泡腔；卵母细胞被挤向一边，并包裹在一团颗粒细胞中，形成半岛突出在卵泡腔内，称卵丘；在颗粒层外周形成两层卵泡膜；卵的透明带周围的柱状上皮细胞呈放射状排列，称为放射冠，放射冠细胞有微绒毛，并伸入透明带内。

（5）成熟卵泡：三级卵泡继续生长，卵泡液增多，卵泡腔增大，卵泡扩展到整个皮质部而突出卵巢表面。

（6）黄体：是排卵后的卵泡转变成的富于血管的内分泌器官，牛、羊、猪的黄体位于卵巢皮质，突出于卵巢表面，马的黄体则完全埋藏在卵巢基质内。黄体由颗粒黄体细胞和泡膜黄体细胞组成，颗粒黄体细胞占多数，大部分位于黄体中间，细胞呈多面体，着色浅，排列紧密，含有球形细胞核；泡膜黄体细胞则小，大部分位于黄体外周，包在颗粒黄体细胞外周或位于其之间，核占胞体的大部分，核与胞质染色较深。

（7）闭锁卵泡：卵巢内在各个发育阶段逐渐退化的卵泡叫闭锁卵泡，即退化的卵母细胞存在于未破裂的卵泡中，可观察到萎缩的卵母细胞和膨胀塌陷的透明带。

（三）雌性动物子宫、输卵管的组织学观察：

1．子宫

子宫的组织构造从外向里为浆膜、肌层和粘膜。肌肉层的外层薄，为纵行的肌纤维；内层厚，为螺旋形的环状肌纤维。子宫颈肌可看作子宫肌的附着点，同时也是子宫的括约肌，其内层特别厚，且有致密的胶原纤维和弹性纤维，是子宫颈皱襞的主要构成部分，内外两层交界处有交错的肌束和血管网，固有层含有子宫腺，子宫腺以子宫角最发达，子宫体较少，子宫颈则在皱襞之间的深处有腺状结构，其余部分为柱状细胞，能分泌粘液。

2．输卵管

输卵管的管壁组织结构从外向内由浆膜、肌层和粘膜组成，肌层可分为内层环状或螺旋状肌束和外层纵行肌束，其中混有斜行纤维，使整个管壁能协调的收缩。肌层从卵巢端到子宫端逐渐增厚，输卵管粘膜形成若干初级纵襞，在壶腹部又分出许多次级纵襞。输卵管上皮细胞有柱状纤毛细胞和无纤毛细胞，柱状纤毛细胞在输卵管的卵巢端，特别在伞，越向子宫端越少，这种细胞伸入管腔。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

实验三  PMSG或FSH的生物测定法

 

一、实验目的

测定PMSG（或FSH）的活性，掌握该激素的简易效价测定方法。

二、实验原理

FSH为垂体促性腺激素，作用于即将达到性成熟年龄的雌性小白鼠，可促进卵巢上的卵泡发育，分泌雌激素。在雌激素的作用下，又可促进子宫、卵巢及整个生殖器官的发育、增大。PMSG因为也含有FSH，因此具有与FSH相同的生物学作用，也能促进性成熟前的小白鼠子宫发育增大。

PMSG在机体内的作用期比FSH长，因此在测试效价过程中，PMSG可作一次注射，而FSH需经多次注射。

三、实验材料

1、实验动物  健康无伤残的18-23日龄（即将达到性成熟日龄）、体重9-13g的同源雌性小白鼠。各测试组实验鼠出生日龄相差不得越过三天，体重相差不得超过2g。

2、测定样品  PMSG（或FSH）、生理盐水。

3、测定器具  1ml注射器、4号针头、0.1ml微量注射器、1ml和2ml吸管、吸耳球、酒精棉球、剪刀、镊子、搪瓷盘、解剖板、鼠罐和青霉素瓶（稀释瓶）。

四、测试方法

1、测试组的确定

为了测得精确效价，应先将各测试样品浓度组距加大进行粗测，从而确定样品的大致效价范围，再将测试样品浓度组距减少，以测得样品较为精确的效价，可按下表选择确定测试组。

①PMSG测试组的确定

每0.1mlPMSG，按下表加入不同量的生理盐水，稀释成不同浓度作为各测试组。

PMSG稀释浓度换算小白鼠单位

每mlPMSG中加入生理盐水量

稀释液中PMSG浓度

PMSG小白鼠单位（Mu/ml）

11

1/12

60

15

1/16

80

19

1/20

100

23

1/24

120

27

1/28

140

31

1/32

160

35

1/36

180

39

1/40

200

43

1/44

220

47

1/48

240

②FSH测试组的确定

FSH是瓶装粉剂，故在配制不同浓度的测试组之前，需用一定量的生理盐水稀释成溶液，测出每ml溶液中的效价值后，即可换算出该瓶装内FSH的效价值。每只鼠注入总剂量需分作五次注射，每天注射两次。在常温条件下，稀释后的FSH容易失活，效价降低。因此在注射期间的FSH溶液应在低温下保存。在测试中，每瓶FSH准确取5ml生理盐水稀释作为母液，于0-5℃下存放。用FSH母液为小白鼠作五次注射，故每次注射剂量应是总剂量的五分之一。因此取配制好的母液0.2ml加生理盐水0.8ml，经一次稀释成工作液，再取0.1ml工作液，按下表所示加入不同量的生理盐水，即可配制成不同浓度的测试组。

加生理盐水（ml）

溶液量（ml）

溶液浓度

注射鼠数（只）

母液/只鼠（ml）

Mu/ml

1.1

1.5

1.9

2.3

2.7

3.1

3.5

3.9

4.3

4.7

1.2

1.6

2.0

2.4

2.8

3.2

3.6

3.6

4.4

4.8

1/12

1/16

1/20

1/24

1/28

1/36

1/36

1/40

1/44

1/48

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

1/60

1/80

1/100

1/120

1/140

1/160

1/180

1/200

1/220

1/240

60

80

100

120

140

160

180

200

200

240

一瓶装的FSH经1ml生理盐水稀释成母液，可配制成10个测试组，为50只小白鼠注射。

2、小白鼠称重分组

各测试组小白鼠组内体重的差异不得超过2g，将小白鼠分为5组，每组5只，分别编号，其中一组为对照组，注射同样剂量的生理盐水。其余四组为测试不同浓度样品的测试组。

3、注射

将稀释好的药剂分别给各组的小白鼠腹部皮下注射0.2ml，对照组注射生理盐水，注意注射量力求准确，不得使药液注射胸腔或腹腔或逸出体外。

4、剖检

于注射药液后72～76小时，先用颈椎脱臼法或撞击头部法处死小白鼠，用图钉将小白鼠固定于解剖板上，用剪刀剪开腹腔，将子宫卵巢剥离取出，观察子宫增大情况。

5、效价确定

将各组子宫与对照组比较，每组5只小白鼠中有3只或3只以上子宫增大一倍以上，则定为阳性反应。根据各测试组中呈阳性反应的最低浓度组效价值，换算出被测样品中PMSG（或FSH）的小白鼠单位。

假设稀释液中PMSG浓度为1/x，若稀释后浓度在1/x以上各组均呈阳性反应，则1/x浓度的测试组为呈阳性反应的最低浓度。实际注入鼠体内的供试品药液量为1/x·1/5ml=1/5x ml，则1ml供试品药液中含有的生物效价为5x小白鼠单位（Mu）。

实验四  精液品质常规检查及理化因素的影响

 

一、实验目的

掌握检查精子密度、活率的方法，熟悉肉眼检查精液品质的方法，验证实验观察理化因素对精子运动及生存能力的影响。

二、实验材料

1、动物：种公羊、母羊、种公牛、母牛。

2、药械用品：牛、羊假阴道全套、3%和0.9%氯化钠溶液、浸润剂（11份石蜡油+2份凡士林）、温度计、镊子、漏斗、玻璃棒、大搪瓷盘、热水、显微镜、载玻片、盖玻片、乙醚、纱布、试管、2%煤酚皂液、1/1000新洁尔灭、保温箱、冰、酒精、美兰。

3、冻精颗粒

三、实验内容

（一）精液的肉眼检查 

1、射精量：将采得的精液倒入有刻度的试管或杯中，测其容量。各种家畜的平均射精量为：马70（30-100）毫升；驴50（20-80）毫升；牛（2-10）毫升；羊1（0.7-2）毫升；猪250（150-500）毫升。

2、观察精液的色泽并嗅闻气味。

3、云雾状的观察：观察精液的云雾状翻腾滚动。按以下符号记入表内，云雾状显著者，以“+++”表示，有云雾状以“++”表示；云雾状不明显者以“+”表示。

（二）精子密度检查及活率评定

1、检查精子的密度：取一小滴精液于清洁的载玻片上，加上盖玻片，使精液分散成均匀一薄层，但不得有气泡，也不能使精液外流或溢于盖玻片上，置显微镜下放大400-600倍观察，按下列等级评定其密度。

密——在整个视野中精子密度很大，彼此间空隙很小，看不清各个精子运动的活动情况，这一级属于“密”，每毫升含精子数约在10亿以上。

中——精子之间的空隙明显，精子彼此之间距离约有一个精子的长度。有些精子的活动情况可以清楚地看到。这种精液的密度评为“中”，每毫升所含精子数约在2-10亿之间。

稀——精子分散存在，精子间的空隙超过一个精子长度，这种精液每毫升所含精子在2亿以下。

2、评定精子的活率：必须于采精后立刻在18-25℃实验室中进行，最好在37℃保温箱内进行，同时也可以测定精子的密度。

用玻棒蘸取一滴原精液或稀释的精液（马、猪精液密度低不须稀释，牛、羊密度大，需用0.9%氯化钠溶液稀释，其温度相近），滴在载玻片上，也可滴在载玻片上翻放于凹玻片的凹窝上，最后置于显微镜下，放大250-400倍检查，显微镜载物台须放平。并最好在暗视野中进行。

精子的活动有三种类型：前进运动、旋转运动和振摆运动，评价精子活率是根据前进运动精子数多少而定。

 

目前评定精子活率等级的方法有两种：

十级制——在显微镜下估计直线前进运动精子所占百分数，直线前进运动精子为100%者评为1.0级；90%者评为0.9级，依此类推。

五级制——全部精子呈前进运动者属于“5”级，绝大多数精子（约80%）呈前进运动者为“4”级，前进运动的精子略多于半数者（约60%）为“3”级；不及半数者为“2”级，呈前进运动的精子数目极少者属“1”级。

牛及羊的精液中由于副性腺分泌物少，要求“密5”即密度为“密”，活率为“5”级及“密4”或“中5”及“中4”一级才能作为输精之用。马与猪的精液中副性腺分泌多，就是“稀5”甚至“稀3”的亦可用于输精。

（三）理化因素对精子的影响

1、温度的影响

①取采得的原精液一滴滴在载玻片上，放在显微镜下观察其活率，再放在45-50℃下2分钟观察精子活率有何变化。

②将新采得精液立即检查其活率后，随后即移入0-5℃温度下2-3分钟，温度回升到37-38℃后再检查精子活率，注意降温前后精子活率变化情况。

2、渗透压的影响：观察原精液的活率后，分别在三滴原精液内各加入1%氯化钠溶液、3%氯化钠溶液和蒸馏水，观察其活率及形态有何变化。

3、取1-2毫升经稀释过的精液放入小试管中，经检查活率后，用手上下剧烈振动2-3分钟，再观察精子活率有何变化。

4、取1-2毫升稀释过的精液放入小试管中，经检查活率后，在太阳光下照射10分钟，观察精子活率有何变化。

5、化学药品的影响：取一滴精液于载玻片上，用滴管分别滴入以下药液混合后复以盖玻片。

①2%煤酚皂液。

②1/3000新洁尔灭液。

③75%酒精。

分别观察其精子活率及形态有何变化。

四、作业

将本次实验所测结果分别填入下列表内。

理化因素对精子活率影响记载表

处理前

活率评分

处理后

活率评分

37～38℃

 

40～45℃

 

降温处理前

 

降温处理后

 

加入不同浓度溶液前

 

加入1%Nacl溶液后

加入3%Nacl溶液后

加入蒸馏水后

 

 

 

振荡前

 

经剧烈振动

 

阳光照射前

 

阳光照射后

 

加入药液前

 

加入2%棉酚皂液

加入1/1000新洁尔灭溶液

加入75%酒精后

 

4—3
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

实验五  精子数量计算和畸形率的测定

 

一、实验目的

掌握用血球计数板检查单位容积（毫升）中所含精子数的方法，以及测定精子畸形率的操作要点。

二、实验材料

1、材料：公牛、公羊、公马、公猪精液。

2、器械及用品：显微镜、载玻片、玻棒、0.9%Nacl溶液、95%和75%的酒精、染色缸、3%盐水、兰墨水、0.5%龙胆紫酒精溶液、红、白血球稀释管、血球计数板、5ml试管、血吸管和1ml吸管。

3、畸形精子形态图。

三、实验内容

血球计算盘构造模式图。

（一）精子数量计算

1、精液稀释：

①用1ml吸管吸3%NaCl 0.2ml或2ml，放入小试管中，（根据稀释倍数确定）用血吸管吸出10或20mlNaCl抛掉。

②用血吸管将精液吸至刻度10或20ml处。

③用纱布擦去吸管尖端所附的精液。

④用拇指按住试管口，振荡2-3分钟使其均匀混合。

2、精子的计数：

①将擦洗干净的计数板放于显微镜的载物台上，盖上盖玻片。

②将试管中稀释好的精液滴一滴于计数板盖玻片的边缘使精液自动渗进计数室，注意不要使精液溢出于盖玻片处，并不可使精液不够而致计数室内有气泡或干燥之处，如有这些现象应重做。

③静置3分钟便可在400-600倍的显微镜下检查。

④数出计数室的四角及中央共五个大方格即80个小方格内的精子数。

⑤计数每小格内的精子，只数格内及压在左线和上线者。

⑥由五个大方格（80个小方格）所数到的精子数代入下式，即得出每毫升的精子数：

1ml原精液内的精子数 = x（5个大方格内的精子数）×5（等于25个大方格内的精子数）×10（等于1mm3内的精子数）×1000（等于1ml被检稀释精液样品内精子数）×被检精液稀释倍数

为了减少误差，必须进行两次计数，如果前后两次误差大于10%，应作第三次检查。最后在三次检查中取两次误差不超过10%的，求出平均数，即为所确定的精子数。

5—2
 
（二）直线运动精子数的计算（精子活率的计算）

方法基本和精子数量计算法相同，有以下几点不同。

1、用0.9%生理盐水作为稀释剂，以保持正常活精子运动。

2、显微镜置于保温箱中，保持37-38℃。

3、计数四角及中央五个方格中的非直线运动精子数（包括死精子，摆动旋转运动的精子），求出每毫升精液中非直线运动的精子数。

5、计算直线运动精子的百分数

（三）测定精子畸形率

1、以细玻璃棒蘸精液一滴，滴于载玻片上一端，如果是牛羊精液应再加1-2滴0.9%氯化钠溶液。

2、以另一载玻片的顶端呈35°角抵于精液滴上，并向另一端推去，将精液均匀涂抹于载玻片上。

3、将抹片放于空气中干燥。

4、用下列方法中的任一方法固定染色。

①用0.5%的龙胆紫酒精染色三分钟，水洗，待干后即可镜检（也可用由普通红蓝墨水代替）

②置95%酒精中（或5%福尔马林溶液）固定5-6分钟，取出以水冲洗后，凉干或烘干，用蓝、红墨水等染色3-5分钟，再用水冲洗，干燥后置于显微镜下检查。

5、镜检：将制好的抹片置于显微镜下，查数不同视野的500个精子，计算出其中所含畸形精子数，求出畸形百分率。

四、作业

1、列表记载本次实习所得数值。

2、分析所得数值和一般常数的差异。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

实验六  精子顶体完整率的测定

 

一、实验目的

1、学习精液抹片染色方法。

2、观察正常精子顶体和异常精子顶体状态，计算精子顶体完整率。

二、实验材料

（一）精液样品：

液态精液或解冻精液。

（二）福尔马林磷酸盐固定液配制

1、取2.25gNaH2PO4·12H2O和55gNaH2PO4·2H2O于100ml容量并加入0.89%NaCl溶液约30ml，在30℃温度下静置3-4h使之溶解。

2、加入经MgCO3饱和的甲醛溶液8毫升，其配制方法是在500ml甲醛中加入8gMgCO3，须在一周前配制好，使PH值由原来3.84提高到5.0左右。

3、加0.89%NaCl液至100ml，静置24h，PH值为7.0-7.2。

（三）磷酸盐缓冲液配制

取2.2gNa2HPO4·12H2O和0.55gNaH2PO4·2H2O置于100ml容量瓶中，加入约30ml蒸馏水溶解后用蒸馏水定容至100ml，PH值为7.0-7.2。

（四）姬姆萨原液配制

称取姬姆萨染料1g，甘油66ml，甲醇66ml，将研细的姬姆萨染料加入少量温热（60℃）的甘油，在研钵内研磨直至完全无颗粒呈匀浆而止，再将剩余全部甘油倒入置56℃恒温箱中2h，分次用甲醇清洗容器于棕色瓶保存，二周后使用，此原液放置时间越长越好，使用前过滤。

（五）姬姆萨染液的配制

根据每个抹片需染液2ml来确定所需染液量，配置好的染液需立即使用染色，放置时间过长会使染色效果减退。

姬姆萨染液的配制方法为原染液、缓冲液、蒸馏水的比例为2：3：5。

（六）苏木精——伊红染液的配制

1.苏木精染液

2.伊红染液：0.5%伊红溶液

（七）生物显微镜（1000×油镜）

（八）血球计数板

（九）载玻片、盖玻片、滴管、红布、染色缸、染色架、玻片镊

 

 

三、实验内容

（一）抹片

将需测定精液样品摇匀，在精液的中层用吸管吸取一小滴精液，平滴在载玻片的右端，取另一边缘光滑平直的载玻片呈35°角自精液滴的左面向右接触样品，样品精液即呈条状分布在两个载玻片接触边缘之间，将上面的载玻片贴着平置的载玻片表面自右向左移动，带着精液滴均匀地涂抹在载玻片上，切忌将精液滴“推”过去，否则易造成精子的人为损伤，制作另一抹片时，须重新换取载玻片，在抹片的右端背面用特种铅笔注明标号，每份精液样品须同时制作两个抹片。

（二）风干

自然干燥5-20分钟后即固定染色，不可久置。

（三）固定

将风干抹片平置于染色架上，用滴管吸取1-2ml福尔马林磷酸盐缓冲固定液，滴在抹片上，轻轻摇动，使固定液布满在整个抹片表面，静置固定15分钟。

（四）水洗

用玻片镊夹住抹片一端，将固定液弃至染色缸内，在蒸馏水缸中涮洗，取出立于瓷盘边待干。

（五）染色

将经固定风干后的抹片平置于染色架上，选用下列任意一种染色液进行染色。

1、用滴管吸取新配制的姬姆萨染色液2ml，自左向右滴在涂片上，使染液均匀布满抹片上，静置染色90分钟。

2、取苏木精染液，滴于风干后的抹片上，静置15分钟，用蒸馏水洗去染色液体，待其自然风干后，再用0.5%伊红复染液滴于经苏木精初染的抹片上复染2-3分钟。

（六）水洗

用（四）的方法水洗除去抹片上的染色体液，每张抹片经数次涮洗，直至水洗液无色为止，风干待镜检观察。

（七）精子顶体的观察

将精液样品抹片置于1000倍生物显微镜下用油镜头观察或者用相差显微镜（10×40×1.25倍）观察。用姬姆萨液染色时，精子的顶体呈紫色，而用苏木精——伊红液染色时，精子的细胞膜呈黑色，顶体和核染成紫红色。

按照精子形态，细胞膜及顶体的完整与否，将精子顶体状态分为四种类型。

1、顶体完整型：精子头部外形正常，细胞膜和顶体完整、着色均匀、顶脊、赤道段清晰。

2、顶体膨变型：顶体着色均匀，但头部边缘不整齐呈畸形，核前细胞膜不明显或部分缺损。

3、顶体破损型：顶体着色不均匀，顶体脱离细胞核，形成缺口或陷凹。

4、顶体全脱型：赤道段以前的细胞膜缺损，顶体已全部脱离细胞核。

 

（八）计算

在每张抹片上观察300个精子，并统计出顶体完整型精子数。

精子顶体完整率（%）=

要求每张抹片精子顶体完整率差异不超过15%，求出二张抹片平均顶体完整率，即为样品精液的顶体完整率。

四、作业

将试验结果填入下表

畜种（号）：         精液类型：         精液活率：

 

抹片号

顶体完整型（个）

异常顶体类型（个）

顶体完整率

（%）

平均顶体

完整率（%）

顶体膨变型

顶体破损型

顶体全脱型

1

 

 

 

 

 

 

2

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

实验七  人工授精器械的认识及假阴道的准备

 

一、实验目的

认识各种家畜人工授精所用的器械，了解其构造、用途和使用方法，初步掌握假阴道的安装方法。

二、实验材料

1、各种家畜的采精器械。

2、各种家畜的输精器械。

三、实验内容

（一）各种家畜采精器械的认识

各种家畜的采精器械主要是假阴道，由外壳、内胎、集精杯3部分组成。各种家畜的假阴道分别介绍如下：

马：其假阴道外壳是由镀锌铁皮制成的圆筒，外形似大暖瓶，筒体中部有把手，便于采精时把握，侧面有注水孔，可塞进带气嘴的橡皮塞子，由此灌水和充气。内胎是由优质橡胶制成长筒，装于外壳内，两端翻卷固定在外壳内，集精杯为短圆状的黑色橡皮杯，套在外壳的小端。

牛：其假阴道有美式、苏式两种，外壳是由硬橡胶或塑料制成的圆筒，中部有注水孔，塞有带气嘴的橡皮塞，灌水和充气用，内胎同马；集精杯有二种：一种是棕色的双层集精杯，夹层可盛37℃以下温水以保护精液；另一种是在橡皮漏斗上接上一个玻璃管或离心管。

羊：其假阴道构造基本与牛相同，只是较小，集精杯是棕色的双层杯。

猪：其假阴道构造基本与牛、羊相同，只是较牛的短，比羊的粗，集精杯为有色的广口玻璃瓶，容量为350-500ml。在生产实践中，猪采精通常用手握法，须医用乳胶手套和一个保温杯即可。

（二）各种家畜输精器械的认识

各种家畜的输精器械为开张器，输精器和照明灯。

开张器有二种：一种是金属的鸭嘴式开张型的，一种是玻璃或塑料的圆筒式的，各种家畜的开张器只是大小有别。

输精器有玻璃、金属、塑料、橡皮制成的。马、猪的输精器，为一端尖细的优质橡皮管，其大小不一，它的一端接注射器。牛、羊的输精器有玻璃和金属两种，其中大小不一，牛采用直肠把握法输精多用金属输精器。细管冷冻精液，有专用的金属细管输精枪——卡苏枪。

照明灯：可用手电筒、头灯，最实用的为固定在开张器或输精器上的照明灯。

（三）假阴道的安装

安装前的准备

首先检查：

（1）外壳有无裂缝或小孔。

（2）内胎是否漏气，边缘是否裂口。

（3）气门活塞是否有裂口漏气，开关是否灵活。

2、安装方法

（1）内胎光滑面朝内腔装入外壳，两端翻卷于外壳两端，不得扭转，中轴与外壳重合呈同心圆位置，并用橡皮圈固定两端。

（2）由外壳的注水孔注入45～55℃的温水，使采精时的温度为38～42℃，水量为外壳内胎之间容积的1/3～1/2。

（3）装上气门活塞，于一端装上集精杯和保护套。

（4）用玻璃棒涂布润滑剂凡士林或石蜡油。由内向外均匀涂布，深度不超过1/2。

（5）打开开关充气，使内胎呈“Y”形。

（6）用温度计插入假阴道，测量温度为38～42℃，准备采精。

四、作业

试述牛假阴道的组成及安装方法。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

实验八  动物精液的冷冻技术操作

 

一、实验目的

了解精液冷冻保存技术的操作过程，基本掌握冷冻精液的制作技术。

二、实验材料

1、牛、猪精液。

2、药品：葡萄糖、蔗糖、柠檬酸钠、氨基乙酸、三羟基甲基氨基甲烷、甘油、鸡蛋、青霉素、链霉素。

3、器具：液氮罐、保温瓶、温度计、镊子、铝饭盒、氟板、铜纱网、滴管、细管、封口粉、烧杯、量筒、三角烧瓶、瓷盘、纱布、棉花、显微镜、显微镜保温箱、载玻片、盖玻片、天平、滤纸、玻璃球、磁力搅拌器。

三、实验内容

（一）公牛精液的冷冻：

1、稀释液的配制

稀释液配方：12%蔗糖溶液75ml，卵黄20ml，甘油5ml，青霉素500-1000单位/ml，链霉素500-1000μg/ml。

首先配制12%蔗糖溶液，过滤后在水浴中煮沸消毒15分钟，待凉后按比例加卵黄、甘油和青链霉素，用磁力搅拌器或玻璃棒充分搅匀。

2、解冻液的配制

解冻液配方：柠檬酸钠2.9(g)，蒸馏水100ml，配好后过滤，煮沸消毒。

3、颗粒法与细管法（见流程图）

（二）公猪精液的冷冻

1、稀释液配制

稀释液配方：12%蔗糖溶液  75ml   氨基乙酸          0.5g

            柠檬酸钠     0.5g  Tris              0.2g

             卵黄         20ml 双重蒸馏水加至    100ml

            甘油最终浓度  1%       青链霉素          500-1000μg/ml

甘油配制12%蔗糖溶液，并加入氨基乙酸，柠檬酸钠和Tris后过滤煮沸15分钟消毒，待凉后按比例加入卵黄、甘油、青链霉素，充分搅拌均匀。

2、解冻稀释液的配制

解冻稀释液配方：葡萄糖    5g      双蒸水       100ml

                柠檬酸钠  0.5g    10%安钠加    5ml

配好后过滤煮沸消毒

 

 

颗  粒  法                                 细  管  法